Διαδικασία Gram Stain στη Μικροβιολογία

Το Gram stain είναι μια διαφορική μέθοδος χρώσης που χρησιμοποιείται για την εκχώρηση βακτήρια σε μία από τις δύο ομάδες (gram-positive και gram-negative) με βάση τις ιδιότητες του τα κελιά τους. Είναι επίσης γνωστό ως χρώση Gram ή μέθοδος Gram. Η διαδικασία ονομάζεται για το άτομο που ανέπτυξε την τεχνική, τον Δανό βακτηριολόγο Hans Christian Gram.

Η διαδικασία βασίζεται στην αντίδραση μεταξύ πεπτιδογλυκάνης στα κυτταρικά τοιχώματα ορισμένων βακτηρίων. Η χρώση Gram περιλαμβάνει τη βαφή βακτηρίων, τη διόρθωση του χρώματος με ένα mordant, τον αποχρωματισμό των κυττάρων και την εφαρμογή αντίστασης.

1. Ο πρωταρχικός λεκές (κρύσταλλο βιολετί) συνδέεται με πεπτιδογλυκάνη, χρωματίζοντας κύτταρα μωβ. Τόσο τα gram-θετικά όσο και τα gram-αρνητικά κύτταρα έχουν πεπτιδογλυκάνη στα κυτταρικά τους τοιχώματα, έτσι αρχικά, όλα τα βακτήρια χρωματίζουν βιολετί.
2. Ιώδιο Gram (ιώδιο και το ιωδιούχο κάλιο) εφαρμόζεται ως βραδυνό ή στερεωτικό. Τα θετικά κατά gram κύτταρα σχηματίζουν ένα σύμπλοκο κρυσταλλικού ιώδους-ιωδίου.
instagram viewer
3. Αλκοόλ ή ακετόνη χρησιμοποιείται για τον αποχρωματισμό των κυττάρων. Τα αρνητικά κατά gram βακτήρια έχουν πολύ λιγότερη πεπτιδογλυκάνη στα κυτταρικά τους τοιχώματα, οπότε αυτό το βήμα τα καθιστά ουσιαστικά άχρωμα, ενώ μόνο ένα μέρος του χρώματος αφαιρείται από θετικά κατά gram κύτταρα, τα οποία έχουν περισσότερη πεπτιδογλυκάνη (60-90% του κυτταρικού τοιχώματος). Το παχύ κυτταρικό τοίχωμα των θετικών κατά gram κυττάρων αφυδατώνεται από το στάδιο αποχρωματισμού, αναγκάζοντάς τα να συρρικνωθούν και να παγιδεύσουν το σύμπλεγμα λεκέ-ιωδίου.
4. Μετά το στάδιο αποχρωματισμού, εφαρμόζεται μια αντίστροφη βαφή (συνήθως σαφραΐνη, αλλά μερικές φορές φουξίνη) για να χρωματιστούν τα ροζ βακτήρια. Τόσο τα gram-θετικά όσο και τα gram-αρνητικά βακτήρια παίρνουν το ροζ λεκέ, αλλά δεν είναι ορατό πάνω από το πιο σκούρο μοβ των gram-θετικών βακτηρίων. Εάν η διαδικασία χρώσης εκτελείται σωστά, τα θετικά κατά gram βακτήρια θα είναι μοβ, ενώ τα gram-αρνητικά βακτήρια θα είναι ροζ.

Παρατηρούνται τα αποτελέσματα του χρώματος Gram χρησιμοποιώντας μικροσκοπία φωτός. Επειδή τα βακτήρια είναι χρωματισμένα, δεν αναγνωρίζεται μόνο η ομάδα λεκέδων Gram, αλλά το σχήμα τους, το μέγεθος και το σχήμα συσσώρευσης μπορεί να παρατηρηθούν. Αυτό καθιστά το λεκέ Gram ένα πολύτιμο διαγνωστικό εργαλείο για ιατρική κλινική ή εργαστήριο. Ενώ ο λεκές μπορεί να μην προσδιορίσει σίγουρα τα βακτήρια, συχνά γνωρίζοντας εάν είναι gram-θετικά ή gram-αρνητικά αρκεί για τη συνταγογράφηση ενός αποτελεσματικού αντιβιοτικού.

Ορισμένα βακτήρια μπορεί να είναι γραμμο-μεταβλητά ή γραμμάρια-απροσδιόριστα. Ωστόσο, ακόμη και αυτές οι πληροφορίες μπορεί να είναι χρήσιμες για τη μείωση της ταυτότητας των βακτηρίων. Η τεχνική είναι πιο αξιόπιστη όταν οι καλλιέργειες είναι ηλικίας κάτω των 24 ωρών. Ενώ μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε καλλιέργειες ζωμού, είναι καλύτερο να φυγοκεντρηθούν πρώτα. Ο πρωταρχικός περιορισμός της τεχνικής είναι ότι αποδίδει λανθασμένα αποτελέσματα εάν γίνονται λάθη στην τεχνική. Απαιτούνται πρακτικές και δεξιότητες για να παράγουν ένα αξιόπιστο αποτέλεσμα. Επίσης, ένας μολυσματικός παράγοντας μπορεί να μην είναι βακτηριακός. Οι ευκαρυωτικοί παθογόνοι λεκιάζουν αρνητικά κατά gram. Ωστόσο, τα περισσότερα ευκαρυωτικά κύτταρα εκτός από τους μύκητες (συμπεριλαμβανομένης της ζύμης) δεν κολλάνε στη διαφάνεια κατά τη διάρκεια της διαδικασίας.

• Κρύσταλλο βιολετί (πρωτογενής λεκέ)
• Ιώδιο του Gram (κυρίαρχο, για τη στερέωση της κρυσταλλικής βιολετί στο κυτταρικό τοίχωμα)
• Αιθανόλη ή ακετόνη (αποχρωματιστής)
• Safranin (δευτερεύον λεκέ ή αντίστροφη κηλίδα)
• Νερό σε μπουκάλι ψεκασμού ή σταγονόμετρο
• Διαφάνειες μικροσκοπίων
• Σύνθετο μικροσκόπιο

1. Τοποθετήστε μια μικρή σταγόνα βακτηριακού δείγματος σε μια διαφάνεια. Θέρμανση στερεώστε τα βακτήρια στη διαφάνεια περνώντας το μέσα από τη φλόγα ενός καυστήρα Bunsen τρεις φορές. Η εφαρμογή υπερβολικής θερμότητας ή για μεγάλο χρονικό διάστημα μπορεί να λιώσει τα κυτταρικά τοιχώματα των βακτηρίων, παραμορφώνοντας το σχήμα τους και οδηγώντας σε ανακριβές αποτέλεσμα. Εάν εφαρμοστεί πολύ λίγη θερμότητα, τα βακτήρια θα ξεπλυθούν κατά τη διάρκεια της χρώσης.
2. Χρησιμοποιήστε ένα σταγονόμετρο για να εφαρμόσετε το πρωτεύον λεκέ (κρυστάλλινο βιολετί) στη διαφάνεια και αφήστε το να καθίσει για 1 λεπτό. Ξεπλύνετε απαλά τη διαφάνεια με νερό όχι περισσότερο από 5 δευτερόλεπτα για να αφαιρέσετε την περίσσεια λεκέδων. Το ξέβγαλμα πολύ καιρό μπορεί να απομακρύνει πάρα πολύ χρώμα, ενώ δεν ξεπλένεται αρκετά για να αφήσει πολύ λεκέ να παραμείνει σε αρνητικά κατά gram κύτταρα.
3. Χρησιμοποιήστε ένα σταγονόμετρο για να εφαρμόσετε το ιώδιο του Gram στη διαφάνεια για να στερεώσετε την κρυσταλλική βιολέτα στο κυτταρικό τοίχωμα. Αφήστε το να καθίσει για 1 λεπτό.
4. Ξεπλύνετε την πλάκα με αλκοόλ ή ακετόνη περίπου 3 δευτερόλεπτα, ακολουθούμενη αμέσως με απαλό ξέβγαλμα χρησιμοποιώντας νερό. Τα αρνητικά κατά gram κύτταρα θα χάσουν χρώμα, ενώ τα θετικά κατά gram κύτταρα θα παραμείνουν βιολετί ή μπλε. Ωστόσο, εάν ο αποχρωματιστής παραμείνει πολύ μεγάλος, όλα τα κελιά θα χάσουν χρώμα!
5. Εφαρμόστε το δευτερεύον λεκέ, σαφραίνη και αφήστε το να καθίσει για 1 λεπτό. Ξεπλύνετε απαλά με νερό όχι περισσότερο από 5 δευτερόλεπτα. Τα αρνητικά κατά gram κύτταρα πρέπει να χρωματίζονται με κόκκινο ή ροζ χρώμα, ενώ τα θετικά κατά gram κύτταρα θα εξακολουθούν να εμφανίζονται μοβ ή μπλε.
6. Προβολή της διαφάνειας χρησιμοποιώντας σύνθετο μικροσκόπιο. Μπορεί να χρειαστεί μεγέθυνση από 500x έως 1000x για να διακρίνει το σχήμα και τη διάταξη των κυττάρων.

Δεν σχετίζονται όλα τα βακτήρια που αναγνωρίζονται από το Gram stain με ασθένειες, αλλά μερικά σημαντικά παραδείγματα περιλαμβάνουν:

• Γραμμικοί θετικοί κόκκοι (στρογγυλοί):Η ασθένεια του σταφυλοκοκου
• Gram-αρνητικοί κόκκοι:Neisseria meningitidis
• Βακίλοι θετικοί σε γραμμάρια (ράβδοι): Bacillus anthracis
• Gram-αρνητικοί βακίλλοι:Escherichia coli