Το ρυθμιστικό διάλυμα TBE (Tris-βορικό-EDTA) είναι ένα ρυθμιστικό διάλυμα αποτελούμενο από βάση Tris, βορικό οξύ και EDTA (αιθυλενοδιαμινοτετραοξικό οξύ). Αυτό το ρυθμιστικό διάλυμα χρησιμοποιείται συχνά για ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης στην ανάλυση προϊόντων ϋΝΑ τα οποία προκύπτουν από ενίσχυση PCR, πρωτόκολλα καθαρισμού ϋΝΑ ή πειράματα κλωνοποίησης ϋΝΑ.
Χρησιμοποιεί το TBE
Το ρυθμιστικό διάλυμα ΤΒΕ είναι ιδιαίτερα χρήσιμο για τον διαχωρισμό των μικρότερων θραυσμάτων DNA (MW <1000), όπως μικρά προϊόντα της περιοριστικό ένζυμο digests. Το TBE έχει μεγαλύτερη ικανότητα ρύθμισης και θα δώσει μεγαλύτερη ανάλυση από την προσωρινή μνήμη TAE. Το ρυθμιστικό διάλυμα ΤΑΕ (Tris-οξεικό-ΕϋΤΑ) είναι διάλυμα που αποτελείται από βάση Tris, οξικό οξύ και ΕϋΤΑ.
Η ΤΒΕ είναι γενικά πιο ακριβή από την ΤΑΕ και αναστέλλει την ϋΝΑ λιγάση, η οποία μπορεί να προκαλέσει προβλήματα εάν επιδιωχθούν μετέπειτα βήματα καθαρισμού και σύνδεσης DNA. Με τα τρία απλά βήματα που ακολουθούν, μάθετε πώς να κάνετε το buffer TBE. Δεν πρέπει να διαρκέσει περισσότερο από περίπου 30 λεπτά για να δημιουργήσετε.
Ο, τι χρειάζεσαι
Για να δημιουργήσετε προσωρινή μνήμη TBE, θα χρειαστείτε μόνο τέσσερις ουσίες. Τα υπόλοιπα στοιχεία αυτής της λίστας είναι εξοπλισμός. Οι τέσσερις απαιτούμενες ουσίες είναι το δινάτριο άλας EDTA, η βάση Tris, το βορικό οξύ και το απιονισμένο νερό.
Όσον αφορά τον εξοπλισμό, θα χρειαστείτε ένα μετρητή ρΗ και πρότυπα βαθμονόμησης, ανάλογα με την περίπτωση. Επιπλέον, θα θέλετε μερικά ποτήρια ή φιαλίδια 600 ml και 1500 ml. Η στρογγυλοποίηση των αναγκών του εξοπλισμού σας είναι κλιμακωτές φιάλες, αναδευτήρες και αναδευτήρες.
Ελέγξτε το απόθεμα στο εργαστήριο που θα χρησιμοποιήσετε για να βεβαιωθείτε ότι έχετε όλα όσα χρειάζεστε για να ξεκινήσετε. Τίποτα δεν είναι χειρότερο από το να πρέπει να σταματήσετε στη μέση της προετοιμασίας μιας λύσης, επειδή έχετε ξεμείνει από τα κατάλληλα υλικά.
Εάν το εργαστήρι σας βρίσκεται στο σχολείο ή στο εργοτάξιο σας, ελέγξτε με το κατάλληλο προσωπικό για να δείτε ότι έχουν όλα τα αντικείμενα στο απόθεμα. Κάτι τέτοιο μπορεί να σας εξοικονομήσει χρόνο και ενέργεια στο τέλος.
Το βάρος του τύπου εκφράζεται με συντομογραφία ως FW. Είναι το ατομικό βάρος ενός στοιχείου πολλαπλασιασμένου με τον αριθμό των ατόμων κάθε στοιχείου σε μια φόρμουλα, προσθέτοντας στη συνέχεια όλες τις μάζες κάθε στοιχείου μαζί.
Απόθεμα διαλύματος EDTA
Μια λύση EDTA πρέπει να προετοιμαστεί εγκαίρως. Το EDTA δεν θα εισέλθει πλήρως στο διάλυμα μέχρις ότου το ρΗ ρυθμιστεί σε περίπου 8,0. Για ένα αποθεματικό διάλυμα 500 χιλιοστόλιτρων EDTA 0,5 Μ, ζυγίστε 93,05 γραμμάρια δινατρίου άλατος EDTA (FW = 372,2). Στη συνέχεια διαλύεται σε 400 χιλιοστόλιτρα απιονισμένου νερού και ρυθμίζεται το pH με NaOH (υδροξείδιο του νατρίου). Στη συνέχεια, συμπληρώστε το διάλυμα σε τελικό όγκο 500 χιλιοστολίτρων.
Απόθεμα διαλύματος ΤΒΕ
Δημιουργήστε ένα συμπυκνωμένο (5χ) αποθεματικό διάλυμα ΤΒΕ βάρους 54 γραμμαρίων βάσης Tris (FW = 121.14) και 27,5 γραμμάρια βορικού οξέος (FW = 61,83) και διαλύοντας και τα δύο σε περίπου 900 χιλιοστόλιτρα απιονισμένου νερό. Στη συνέχεια προστίθενται 20 χιλιοστόλιτρα EDTA (γραμμομοριακότητας ή συγκέντρωσης) 0,5 Μ (ρΗ 8,0) και ρυθμίζεται το διάλυμα σε τελικό όγκο 1 λίτρου. Αυτό το διάλυμα μπορεί να αποθηκευτεί σε θερμοκρασία δωματίου, αλλά ένα ίζημα θα σχηματιστεί σε παλαιότερα διαλύματα. Αποθηκεύστε το ρυθμιστικό σε γυάλινες φιάλες και απορρίψτε αν έχει σχηματιστεί ένα ίζημα.
Λύση εργασίας της TBE
Για ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης, μπορεί να χρησιμοποιηθεί ρυθμιστικό διάλυμα ΤΒΕ σε συγκέντρωση 0,5χ (1:10 αραίωση του συμπυκνωμένου αποθέματος). Αραιώστε το διάλυμα αποθέματος κατά 10 φορές σε απιονισμένο νερό. Οι τελικές συγκεντρώσεις διαλυμάτων είναι 45 mM Tris-βορικό και 1 mM (millimolar) EDTA. Το buffer είναι τώρα έτοιμο για χρήση σε τρέχοντας ένα πήκτωμα αγαρόζης.