Το ρυθμιστικό διάλυμα ΤΑΕ είναι διάλυμα που αποτελείται από βάση Tris, οξικό οξύ και EDTA (Tris-acetate-EDTA). Είναι ιστορικά το πιο συνηθισμένο ρυθμιστικό διάλυμα που χρησιμοποιείται για πήκτωμα αγαρόζης ηλεκτροφόρηση στις αναλύσεις προϊόντων ϋΝΑ που προκύπτουν από PCR ενίσχυση, DNA πρωτόκολλα καθαρισμού ή Κλωνοποίηση DNA πειράματα.
Αυτό το ρυθμιστικό έχει χαμηλή ιοντική ισχύ και χαμηλή ικανότητα ρύθμισης. Είναι καλύτερα προσαρμοσμένο στην ηλεκτροφόρηση μεγάλων κομματιών DNA (> 20 kilobases) και θα πρέπει να αντικαθίσταται συχνά ή να επανακυκλοφορεί για μεγαλύτερους χρόνους (> 4 ώρες). Με αυτό κατά νου, μπορεί να θέλετε να εξετάσετε τη λήψη αρκετών παρτίδων του buffer.
Δεδομένου ότι το buffer είναι εύκολο να γίνει και τα βήματα μπορούν να γίνουν γρήγορα, κάνοντας περισσότερες από μία παρτίδες τη φορά δεν θα πρέπει να είναι ιδιαίτερα χρονοβόρες ή δύσκολες. Χρησιμοποιώντας τις παρακάτω οδηγίες, θα πρέπει να διαρκέσει μόλις 30 λεπτά για να δημιουργήσετε το buffer της TAE.
Τι χρειάζεστε για το Buffer TAE
Δεδομένου ότι η δημιουργία του buffer TAE απαιτεί μόνο ένα γρήγορο και απλό σύνολο οδηγιών, ο αριθμός των υλικών που απαιτούνται γι 'αυτό δεν είναι υπερβολικός. Θα χρειαστείτε μόνο δινάτριο άλας EDTA (αιθυλενοδιαμινοτετραοξικό οξύ), βάση Tris και παγόμορφο οξικό οξύ.
Η δημιουργία του buffer απαιτεί επίσης έναν μετρητή ρΗ και πρότυπα βαθμονόμησης, ανάλογα με την περίπτωση. Θα χρειαστείτε επίσης δοχεία ή φιαλίδια των 600 χιλιοστόλιτρων και 1500 χιλιοστόλιτρων καθώς και κυλίνδρους με διαβαθμίσεις. Τέλος, θα χρειαστείτε απιονισμένο νερό, αναδευτήρες και ανακατεύετε πλάκες.
Στις επόμενες οδηγίες, το βάρος του τύπου (η ατομική μάζα κάθε στοιχείου πολλαπλασιάζεται με τον αριθμό των ατόμων, τότε η μάζα καθενός προστίθεται μαζί) συντομεύεται ως FW.
Προετοιμάστε μια λύση αποθέματος EDTA
Μια λύση EDTA προετοιμάζεται μπροστά από το χρόνο. Το EDTA δεν θα φτάσει τελείως σε διάλυμα μέχρις ότου το ρΗ ρυθμιστεί σε περίπου 8,0. Για ένα απόθεμα των 500 χιλιοστολίτρων διάλυμα EDTA 0,5 Μ (γραμμομοριακότητα ή συγκέντρωση), ζυγίζονται 93,05 γραμμάρια δινατρίου άλατος EDTA (FW = 372,2). Διάλυση σε 400 χιλιοστόλιτρα απιονισμένου νερού και ρύθμιση του pH με υδροξείδιο του νατρίου (NaOH). Συμπληρώστε το διάλυμα σε τελικό όγκο 500 ml.
Δημιουργήστε τη λύση αποθεμάτων σας
Δημιουργήστε ένα συμπυκνωμένο (50x) αποθεματικό διάλυμα ΤΑΕ ζυγίζοντας 242 γραμμάρια βάσης Tris (FW = 121.14) και διαλύοντας το σε περίπου 750 χιλιοστόλιτρα απιονισμένου νερού. Προσθέστε προσεκτικά 57,1 χιλιοστόλιτρα παγετώδους οξέος και 100 χιλιοστόλιτρα 0,5 Μ EDTA (pH 8,0).
Στη συνέχεια ρυθμίστε το διάλυμα σε τελικό όγκο 1 λίτρου. Αυτό το απόθεμα μπορεί να αποθηκευτεί σε θερμοκρασία δωματίου. Το ρΗ αυτού του ρυθμιστικού διαλύματος δεν ρυθμίζεται και θα πρέπει να είναι περίπου 8,5.
Προετοιμάστε μια Λειτουργική Λύση του Buffer TAE
Το διάλυμα εργασίας του ρυθμιστικού διαλύματος 1x TAE γίνεται με απλή αραίωση του αποθεματικού διαλύματος κατά 50 φορές σε απιονισμένο νερό. Οι τελικές συγκεντρώσεις διαλυμάτων είναι 40 mM (millimolar) Tris-acetate και 1 mM EDTA. Το ρυθμιστικό είναι τώρα έτοιμο για χρήση κατά τη λειτουργία ενός πηκτώματος αγαρόζης.
Τυλίγοντας
Ελέγξτε το απόθεμα προτού αρχίσετε να βεβαιώνεστε ότι έχετε όλα τα παραπάνω υλικά για το buffer της TAE. Το προσωπικό προμηθειών σας θα πρέπει να μπορεί να σας πει εάν έχει όλα τα αντικείμενα που χρειάζεστε σε απόθεμα. Δεν θέλετε να χάσετε κάτι στη μέση της διαδικασίας.