Το πεδίο του βιοτεχνολογία είναι μια συνεχής αλλαγή. Η ταχεία ανάπτυξη και ανάπτυξη της έρευνας αιχμής εξαρτάται από την καινοτομία και τη δημιουργικότητα της επιστήμονες και την ικανότητά τους να δουν το δυναμικό σε μια βασική μοριακή τεχνική και να την εφαρμόσουν σε νέες διαδικασίες. Η εμφάνιση αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR) άνοιξε πολλές πόρτες στη γενετική έρευνα, συμπεριλαμβανομένου ενός μέσου Ανάλυση DNA και την ταυτοποίηση διαφορετικών γονιδίων με βάση τις ακολουθίες DNA τους. Η αλληλούχιση του DNA εξαρτάται επίσης από την ικανότητά μας να χρησιμοποιήσουμε ηλεκτροφόρηση πηκτής για να διαχωρίσετε τους κλώνους του DNA που διαφέρουν ως προς το μέγεθος με ένα μόνο ζεύγος βάσης.
DNA Sequencing
Στα τέλη της δεκαετίας του 1970 εφευρέθηκαν δύο τεχνικές προσδιορισμού αλληλουχίας DNA για μεγαλύτερα μόρια ϋΝΑ: τη μέθοδο Sanger (ή διδεόξυ) και τη μέθοδο Maxam-Gilbert (χημική διάσπαση). Η μέθοδος Maxam-Gilbert βασίζεται σε ειδική διάσπαση νουκλεοτιδίων με χημικά και χρησιμοποιείται καλύτερα για αλληλουχία ολιγονουκλεοτιδίων (μικρά νουκλεοτιδικά πολυμερή, συνήθως μικρότερα από 50 ζεύγη βάσεων σε μήκος). Η μέθοδος Sanger χρησιμοποιείται συνηθέστερα επειδή έχει αποδειχθεί τεχνικά ευκολότερο να εφαρμοστεί και, με το η έλευση της PCR και η αυτοματοποίηση της τεχνικής, εφαρμόζεται εύκολα σε μακριούς κλάδους του DNA, συμπεριλαμβανομένων ορισμένων ολόκληρων γονίδια. Αυτή η τεχνική βασίζεται στον τερματισμό της αλυσίδας με διδεοξυνουκλεοτίδια κατά τη διάρκεια αντιδράσεων επιμήκυνσης PCR.
Μέθοδος Sanger
Στη μέθοδο Sanger, ο κλώνος DNA που πρόκειται να αναλυθεί χρησιμοποιείται ως εκμαγείο και η DNA πολυμεράση χρησιμοποιείται, σε αντίδραση PCR, για την παραγωγή συμπληρωματικών κλώνων χρησιμοποιώντας εκκινητές. Κατασκευάζονται τέσσερα διαφορετικά μίγματα αντίδρασης PCR, που το καθένα περιέχει ένα ορισμένο ποσοστό αναλόγων διδεοξυνουκλεοσιδίου τριφωσφορικού (ddNTP) σε ένα από τα τέσσερα νουκλεοτίδια (ΑΤΡ, ΟΤΡ, ΟΤΡ ή ΤΤΡ).
Η σύνθεση του νέου κλώνου DNA συνεχίζεται μέχρις ότου ενσωματωθεί ένα από αυτά τα ανάλογα, οπότε ο κλώνος είναι πρόωρα περικομμένος. Κάθε αντίδραση PCR θα καταλήξει να περιέχει ένα μείγμα διαφορετικών μηκών ϋΝΑ κλώνων, όλα τα οποία τελειώνουν με το νουκλεοτίδιο το οποίο είναι επισημασμένο με διδεοξυ για την αντίδραση αυτή. Γέλη ηλεκτροφόρηση χρησιμοποιείται στη συνέχεια για να διαχωρίσει τους κλώνους των τεσσάρων αντιδράσεων σε τέσσερις ξεχωριστές λωρίδες και να προσδιορίσει την αλληλουχία του αρχικού προτύπου με βάση το ποια μήκη των κλώνων τελειώνουν με το ποιο νουκλεοτίδιο.
Στην αυτοματοποιημένη αντίδραση Sanger, χρησιμοποιούνται εκκινητές οι οποίοι είναι επισημασμένοι με τέσσερις διαφορετικές εγχάρακτες ετικέτες φθορισμού. Οι αντιδράσεις PCR, παρουσία των διαφόρων διδεοξυνουκλεοτιδίων, εκτελούνται όπως περιγράφεται παραπάνω. Εν τούτοις, στη συνέχεια, τα τέσσερα μίγματα αντίδρασης στη συνέχεια συνδυάζονται και εφαρμόζονται σε μία λωρίδα μιας γέλης. Το χρώμα κάθε θραύσματος ανιχνεύεται χρησιμοποιώντας μια δέσμη λέιζερ και οι πληροφορίες συλλέγονται από έναν υπολογιστή η οποία παράγει χρωματογραφήματα που δείχνουν κορυφές για κάθε χρώμα, από τα οποία μπορεί να είναι η αλληλουχία ϋΝΑ εκμαγείου προσδιορίζεται.
Τυπικά, η μέθοδος αυτοματοποιημένης αλληλούχησης είναι ακριβής μόνο για αλληλουχίες μέχρι το μέγιστο μήκος περίπου 700-800 ζευγών βάσεων. Ωστόσο, είναι δυνατό να αποκτηθούν πλήρεις αλληλουχίες μεγαλύτερων γονιδίων και, στην πραγματικότητα, ολόκληρα γονιδιώματα, με τη χρήση μεθόδων με βήμα-βήμα όπως Primer Walking και Shotgun sequencing.
Στο Primer Walking, ένα εύχρηστο τμήμα ενός μεγαλύτερου γονιδίου προσδιορίζεται ως προς την αλληλουχία χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Sanger. Νέοι εκκινητές δημιουργούνται από ένα αξιόπιστο τμήμα της αλληλουχίας και χρησιμοποιούνται για να συνεχιστεί η αλληλουχία του τμήματος του γονιδίου που ήταν εκτός της εμβέλειας των αρχικών αντιδράσεων.
Η ανάλυση αλληλουχίας κυνηγετικών όπλων συνεπάγεται την τυχαία κοπή του ενδιαφέροντος τομέα DNA σε πιο κατάλληλη (διαχειρίσιμα) μεγέθη θραυσμάτων, προσδιορισμός της αλληλουχίας κάθε θραύσματος και διευθέτηση των τεμαχίων με βάση την επικάλυψη ακολουθίες. Αυτή η τεχνική έχει διευκολυνθεί από την εφαρμογή λογισμικού υπολογιστή για την τοποθέτηση των επικαλυπτόμενων τεμαχίων.