Όλα για τα ένζυμα περιορισμού

Οι περιοριστικές ενδονουκλεάσες είναι μια κατηγορία ένζυμο που έκοψαν μόρια DNA. Κάθε ένζυμο αναγνωρίζει μοναδικές αλληλουχίες νουκλεοτιδίων σε ένα νήμα DNA - συνήθως περίπου τέσσερα έως έξι ζεύγη βάσεων. Οι αλληλουχίες είναι παλινδρομικές στο ότι ο συμπληρωματικός κλώνος DNA έχει την ίδια αλληλουχία στην αντίστροφη κατεύθυνση. Με άλλα λόγια, και οι δύο κλώνοι του DNA κόβονται στην ίδια θέση.

Τα ένζυμα περιορισμού βρίσκονται σε πολλά διαφορετικά στελέχη βακτηρίων όπου ο βιολογικός τους ρόλος είναι να συμμετέχουν στην κυτταρική άμυνα. Αυτά τα ένζυμα περιορίζουν το ξένο (ιικό) DNA που εισέρχεται στα κύτταρα καταστρέφοντάς τα. Τα κύτταρα ξενιστές έχουν ένα σύστημα τροποποίησης περιορισμού που μεθυλιώνει το δικό τους DNA σε θέσεις ειδικές για τα αντίστοιχα ένζυμα περιορισμού τους, προστατεύοντάς τα έτσι από τη διάσπαση. Περισσότερα από 800 γνωστά ένζυμα έχουν ανακαλυφθεί ότι αναγνωρίζουν περισσότερες από 100 διαφορετικές αλληλουχίες νουκλεοτιδίων.

Υπάρχουν πέντε διαφορετικοί τύποι περιοριστικών ενζύμων. Ο τύπος Ι κόβει το DNA σε τυχαίες τοποθεσίες έως και 1.000 ή περισσότερα ζεύγη βάσεων από τον ιστότοπο αναγνώρισης. Ο τύπος III κόβει περίπου 25 ζεύγη βάσεων από τον ιστότοπο. Και οι δύο αυτοί τύποι απαιτούν ATP και μπορούν να είναι μεγάλα ένζυμα με πολλαπλές υπομονάδες. Τα ένζυμα τύπου II, τα οποία χρησιμοποιούνται κυρίως στη βιοτεχνολογία, κόβουν το DNA εντός της αναγνωρισμένης αλληλουχίας χωρίς την ανάγκη για ΑΤΡ και είναι μικρότερα και απλούστερα.

Τα ένζυμα περιορισμού τύπου II ονομάζονται σύμφωνα με τα βακτηριακά είδη από τα οποία είναι απομονωμένα. Για παράδειγμα, το ένζυμο EcoRI απομονώθηκε από Ε. coli. Το μεγαλύτερο μέρος του κοινού είναι εξοικειωμένο με το E. κρούσματα κόλα στα τρόφιμα.

Τα ένζυμα περιορισμού τύπου II μπορούν να δημιουργήσουν δύο διαφορετικούς τύπους περικοπών ανάλογα με το εάν κόβουν και τα δύο κλώνοι στο κέντρο της ακολουθίας αναγνώρισης ή κάθε κλώνος πλησιέστερα στο ένα άκρο της αναγνώρισης αλληλουχία.

Το προηγούμενο κόψιμο θα δημιουργήσει «αμβλύ άκρα» χωρίς προεξοχές νουκλεοτιδίων. Το τελευταίο δημιουργεί "κολλώδη" ή "συνεκτικά" άκρα επειδή κάθε προκύπτον θραύσμα του DNA έχει μια προεξοχή που συμπληρώνει τα άλλα θραύσματα. Και τα δύο είναι χρήσιμα στη μοριακή γενετική για την παραγωγή ανασυνδυασμένο DNA και πρωτεΐνες. Αυτή η μορφή DNA ξεχωρίζει επειδή παράγεται από τη σύνδεση (σύνδεση μεταξύ) δύο ή περισσότερων διαφορετικών κλώνων που δεν ήταν αρχικά συνδεδεμένοι μεταξύ τους.

Τα ένζυμα τύπου IV αναγνωρίζουν το μεθυλιωμένο DNA και τα ένζυμα τύπου V χρησιμοποιούν RNA για να κόψουν τις αλληλουχίες σε οργανισμούς που εισβάλλουν και δεν είναι παλινδρομικοί.

Τα ένζυμα περιορισμού χρησιμοποιούνται στη βιοτεχνολογία για να κόψουν το DNA σε μικρότερους κλώνους προκειμένου να μελετηθούν οι διαφορές μήκους θραυσμάτων μεταξύ ατόμων. Αυτό αναφέρεται ως πολυμορφισμός μήκους θραυσμάτων περιορισμού (RFLP). Χρησιμοποιούνται επίσης για κλωνοποίηση γονιδίων.

Τεχνικές RFLP έχουν χρησιμοποιηθεί για να προσδιοριστεί ότι άτομα ή ομάδες ατόμων έχουν διακριτές διαφορές στις αλληλουχίες των γονιδίων και τα πρότυπα διάσπασης περιορισμού σε ορισμένες περιοχές του γονιδιώματος. Η γνώση αυτών των μοναδικών περιοχών είναι η βάση για Δακτυλικό αποτύπωμα DNA. Κάθε μία από αυτές τις μεθόδους εξαρτάται από τη χρήση του ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης για το διαχωρισμό των θραυσμάτων DNA. Το ρυθμιστικό TBE, το οποίο αποτελείται από βάση Tris, βορικό οξύ και EDTA, χρησιμοποιείται συνήθως για γέλη αγαρόζης ηλεκτροφόρηση να εξετάσει προϊόντα DNA.

Η κλωνοποίηση συχνά απαιτεί την εισαγωγή ενός γονιδίου σε ένα πλασμίδιο, το οποίο είναι ένας τύπος κομματιού DNA. Τα ένζυμα περιορισμού μπορούν να βοηθήσουν στη διαδικασία λόγω των μονόκλωνων προεξοχών που αφήνουν όταν κάνουν περικοπές. Η DNA λιγάση, ένα ξεχωριστό ένζυμο, μπορεί να ενώσει δύο μόρια DNA με ταιριαστά άκρα.

Έτσι, χρησιμοποιώντας ένζυμα περιορισμού με ένζυμα λιγάσης DNA, κομμάτια DNA από διαφορετικές πηγές μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τη δημιουργία ενός μορίου DNA.