Πώς τα ένζυμα περιορισμού κόβουν τις ακολουθίες DNA;

Στη φύση, οργανισμοί πρέπει συνεχώς να προστατεύονται από ξένους εισβολείς, ακόμη και σε μικροσκοπικό επίπεδο. Στα βακτήρια, υπάρχει μια ομάδα βακτηριακών ενζύμων που λειτουργούν αποσυναρμολογώντας ξένα DNA. Αυτή η διαδικασία αποσυναρμολόγησης ονομάζεται περιορισμός και τα ένζυμα που πραγματοποιούν αυτήν τη διαδικασία ονομάζονται περιοριστικά ένζυμα.

Τα ένζυμα περιορισμού είναι πολύ σημαντικά τεχνολογία ανασυνδυασμένου DNA. Τα ένζυμα περιορισμού έχουν χρησιμοποιηθεί για να βοηθήσουν στην παραγωγή εμβολίων, φαρμακευτικών προϊόντων, καλλιεργειών ανθεκτικών στα έντομα και πολλών άλλων προϊόντων.

Βασικές επιλογές

Τα ένζυμα περιορισμού είναι μια κατηγορία ενζύμων που κόβουν το DNA σε θραύσματα με βάση την αναγνώριση μιας συγκεκριμένης αλληλουχίας νουκλεοτιδίων. Τα περιοριστικά ένζυμα είναι επίσης γνωστά ως περιοριστικές ενδονουκλεάσες.

Ενώ υπάρχουν εκατοντάδες διαφορετικά ένζυμα περιορισμού, όλα λειτουργούν ουσιαστικά με τον ίδιο τρόπο. Καθε ένζυμο έχει αυτό που είναι γνωστό ως ακολουθία αναγνώρισης ή τοποθεσία. Μια ακολουθία αναγνώρισης είναι συνήθως μια συγκεκριμένη, σύντομη νουκλεοτίδιο αλληλουχία στο DNA. Τα ένζυμα κόβονται σε ορισμένα σημεία εντός της αναγνωρισμένης αλληλουχίας. Για παράδειγμα, ένα ένζυμο περιορισμού μπορεί να αναγνωρίζει μια συγκεκριμένη αλληλουχία γουανίνης, αδενίνης, αδενίνης, θυμίνης, θυμίνης, κυτοσίνης. Όταν υπάρχει αυτή η αλληλουχία, το ένζυμο μπορεί να κάνει κλιμακωτές περικοπές στη ραχοκοκαλιά του φωσφορικού σακχάρου στην αλληλουχία.

Αλλά αν τα ένζυμα περιορισμού κόβονται με βάση μια συγκεκριμένη αλληλουχία, πώς τα κύτταρα όπως τα βακτήρια προστατεύουν το δικό τους DNA από τη διάσπαση από περιοριστικά ένζυμα; Σε ένα τυπικό κελί, ομάδες μεθυλίου (CH₃) προστίθενται στις βάσεις της αλληλουχίας για να αποφευχθεί η αναγνώριση από τα περιοριστικά ένζυμα. Αυτή η διαδικασία διεξάγεται από συμπληρωματικά ένζυμα που αναγνωρίζουν την ίδια αλληλουχία νουκλεοτιδικών βάσεων με τα ένζυμα περιορισμού. Η μεθυλίωση του DNA είναι γνωστή ως τροποποίηση. Με τις διαδικασίες τροποποίησης και περιορισμού, τα κύτταρα μπορούν και οι δύο να κόψουν ξένο DNA που ενέχει κίνδυνο για το κύτταρο, διατηρώντας παράλληλα το σημαντικό DNA του κυττάρου.

Με βάση τη δίκλωνη διαμόρφωση του DNA, οι ακολουθίες αναγνώρισης είναι συμμετρικές στις διαφορετικές βάσεις αλλά τρέχουν σε αντίθετες κατευθύνσεις. Θυμηθείτε ότι το DNA έχει «κατεύθυνση» που υποδεικνύεται από τον τύπο άνθρακα στο τέλος του κλώνου. Το 5 'άκρο έχει μια φωσφορική ομάδα συνδεδεμένη ενώ το άλλο 3' άκρο έχει μια υδροξυλομάδα συνδεδεμένη. Για παράδειγμα:

5 'τέλος -... γουανίνη, αδενίνη, αδενίνη, θυμίνη, θυμίνη, κυτοσίνη... - 3 'τέλος

3 'τέλος -... κυτοσίνη, θυμίνη, θυμίνη, αδενίνη, αδενίνη, γουανίνη... - 5 'τέλος

Εάν, για παράδειγμα, το περιοριστικό ένζυμο κόβεται εντός της αλληλουχίας μεταξύ της γουανίνης και της αδενίνης, αυτό θα το έκανε και με τις δύο ακολουθίες αλλά στα αντίθετα άκρα (αφού η δεύτερη ακολουθία τρέχει στο αντίθετο κατεύθυνση). Δεδομένου ότι το DNA κόβεται και στους δύο κλώνους, θα υπάρχουν συμπληρωματικά άκρα που μπορούν να συνδέσουν το υδρογόνο μεταξύ τους. Αυτά τα άκρα ονομάζονται συχνά «κολλώδη άκρα».

Τα κολλώδη άκρα των θραυσμάτων που παράγονται από περιοριστικά ένζυμα είναι χρήσιμα σε εργαστηριακό περιβάλλον. Μπορούν να χρησιμοποιηθούν για να ενώσουν θραύσματα DNA τόσο από διαφορετικές πηγές όσο και από διαφορετικούς οργανισμούς. Τα θραύσματα συγκρατούνται μαζί δεσμοί υδρογόνου. Από χημική άποψη, οι δεσμοί υδρογόνου είναι αδύναμα σημεία έλξης και δεν είναι μόνιμοι. Ωστόσο, χρησιμοποιώντας έναν άλλο τύπο ενζύμου, οι δεσμοί μπορούν να γίνουν μόνιμοι.

Η λιγάση DNA είναι ένα πολύ σημαντικό ένζυμο που λειτουργεί και στα δύο αναπαραγωγή και επισκευή του DNA ενός κυττάρου. Λειτουργεί βοηθώντας τη σύνδεση των κλώνων DNA μαζί. Λειτουργεί καταλύοντας έναν φωσφοδιεστερικό δεσμό. Αυτός ο δεσμός είναι ομοιοπολικό δεσμό, πολύ ισχυρότερο από τον προαναφερθέντα δεσμό υδρογόνου και ικανό να συγκρατεί τα διάφορα θραύσματα μαζί. Όταν χρησιμοποιούνται διαφορετικές πηγές, το προκύπτον ανασυνδυασμένο DNA που παράγεται έχει έναν νέο συνδυασμό γονιδίων.

Υπάρχουν τέσσερις ευρείες κατηγορίες περιοριστικών ενζύμων: ένζυμα τύπου Ι, ένζυμα τύπου II, ένζυμα τύπου III και ένζυμα τύπου IV. Όλα έχουν την ίδια βασική λειτουργία, αλλά οι διαφορετικοί τύποι ταξινομούνται με βάση την αναγνώρισή τους ακολουθία, πώς διασπώνται, τη σύνθεσή τους και τις απαιτήσεις ουσιών τους (την ανάγκη και τον τύπο του συμπαράγοντες). Γενικά, τα ένζυμα τύπου Ι κόβουν το DNA σε τοποθεσίες μακρινές από την αλληλουχία αναγνώρισης. Τύπος II κομμένο DNA εντός ή κοντά στην ακολουθία αναγνώρισης. Τύπος III κομμένο DNA κοντά σε αλληλουχίες αναγνώρισης. και τύπου IV διασπά μεθυλιωμένο DNA.

• Biolabs, Νέα Αγγλία. «Τύποι περιορισμών ενδονουκλεάσες». New England Biolabs: Αντιδραστήρια για τη Βιομηχανία Επιστημών Ζωής, www.neb.com/products/restriction-endonucleases/restriction-endonucleases/types-of-restriction-endonucleases.
• Reece, Jane B. και Neil A. Κάμπελ. Βιολογία Campbell. Benjamin Cummings, 2011.