Ενίσχυση DNA μέσω αντίδρασης αλυσίδας πολυμεράσης

PCR σημαίνει αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης, μια τεχνική μοριακής βιολογίας για την ενίσχυση τμημάτων DNA, δημιουργώντας πολλαπλά αντίγραφα χρησιμοποιώντας ένζυμα DNA πολυμεράσης υπό ελεγχόμενες συνθήκες. Όσο ένα μόνο αντίγραφο ενός τμήματος ή γονιδίου DNA μπορεί να κλωνοποιηθεί σε εκατομμύρια αντίγραφα, επιτρέποντας την ανίχνευση χρησιμοποιώντας βαφές και άλλες τεχνικές οπτικοποίησης.

Αναπτύχθηκε το 1983, η διαδικασία της PCR κατέστησε δυνατή την εκτέλεση Αλληλουχία DNA και να προσδιορίσουν τη σειρά των νουκλεοτιδίων σε μεμονωμένα γονίδια. Η μέθοδος χρησιμοποιεί θερμικό κύκλο ή την επαναλαμβανόμενη θέρμανση και ψύξη της αντίδρασης για τήξη και αντιγραφή DNA. Καθώς συνεχίζεται η PCR, το «νέο» DNA χρησιμοποιείται ως πρότυπο για αντιγραφή και ακολουθεί αλυσιδωτή αντίδραση, ενισχύοντας εκθετικά το πρότυπο DNA.

Οι τεχνικές PCR εφαρμόζονται σε πολλούς τομείς της βιοτεχνολογίας, συμπεριλαμβανομένων μηχανική πρωτεϊνών, κλωνοποίηση, εγκληματολογία (δακτυλικό αποτύπωμα DNA), δοκιμή πατρότητας, διάγνωση κληρονομικών ή / και μολυσματικών ασθενειών και για ανάλυση περιβαλλοντικών δειγμάτων.

Στην ιατροδικαστική, ειδικότερα, η PCR είναι ιδιαίτερα χρήσιμη επειδή ενισχύει ακόμη και τη μικρότερη ποσότητα στοιχείων DNA. Το PCR μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί για την ανάλυση DNA ηλικίας χιλιάδων ετών, και αυτές οι τεχνικές έχουν χρησιμοποιηθεί για να εντοπίσουν τα πάντα, από ένα μαμούθ 800.000 ετών έως τις μούμιες από όλο τον κόσμο.

Αυτό το βήμα είναι απαραίτητο μόνο για πολυμεράσες DNA που απαιτούν PCR θερμής εκκίνησης. Η αντίδραση θερμαίνεται μεταξύ 94 και 96 ° C και διατηρείται για 1-9 λεπτά.

Εάν η διαδικασία δεν απαιτεί αρχικοποίηση, η μετουσίωση είναι το πρώτο βήμα. Η αντίδραση θερμαίνεται στους 94-98 ° C για 20-30 δευτερόλεπτα. Οι δεσμοί υδρογόνου του προτύπου DNA διασπώνται και δημιουργούνται μονόκλωνα μόρια DNA.

Η θερμοκρασία αντίδρασης είναι χαμηλότερη μεταξύ 50 και 65 ° C και διατηρείται για 20-40 δευτερόλεπτα. Οι εκκινητές ανόπτονται στο μονόκλωνο πρότυπο DNA. Η θερμοκρασία είναι εξαιρετικά σημαντική κατά τη διάρκεια αυτού του βήματος. Εάν είναι πολύ ζεστό, το αστάρι μπορεί να μην δεσμεύεται. Εάν είναι πολύ κρύο, το αστάρι μπορεί να δεσμευτεί ατελή. Ένας καλός δεσμός σχηματίζεται όταν η αλληλουχία εκκινητή ταιριάζει πολύ με την ακολουθία προτύπου.

Η θερμοκρασία κατά τη διάρκεια αυτού του σταδίου ποικίλλει ανάλογα με τον τύπο της πολυμεράσης. Η DNA πολυμεράση συνθέτει έναν εντελώς νέο κλώνο DNA.

Αυτό το βήμα εκτελείται στους 70-74 ° C για 5-15 λεπτά μετά τον τελικό κύκλο PCR.

Αυτό το βήμα είναι προαιρετικό. Η θερμοκρασία διατηρείται στους 4-15 ° C και σταματά την αντίδραση.

Κατά τη διάρκεια κάθε κύκλου, το προϊόν (το συγκεκριμένο κομμάτι DNA που αναπαράγεται) διπλασιάζεται.

Καθώς η πολυμεράση DNA χάνει τη δραστικότητα και καταναλώνει αντιδραστήρια, η αντίδραση επιβραδύνεται.

Δεν συσσωρεύεται πλέον προϊόν.