Μέθοδοι καθαρισμού πρωτεϊνών στη βιοτεχνολογία

Ένα σημαντικό συστατικό της βιοτεχνολογικής έρευνας είναι η χρήση τεχνικών μηχανικής πρωτεϊνών για το σχεδιασμό ή την τροποποίηση πρωτεϊνών. Αυτές οι τεχνικές καθαρισμού πρωτεϊνών βελτιστοποιούν τις πρωτεϊνικές ιδιότητες για συγκεκριμένες βιομηχανικές εφαρμογές.

Αυτές οι τεχνικές απαιτούν από τους επιστήμονες να απομονώσουν και να καθαρίσουν τις πρωτεΐνες που μας ενδιαφέρουν, έτσι ώστε να μπορούν να μελετηθούν οι ιδιαιτερότητες των υποστρωμάτων τους. Επίσης απαιτούν μελέτη είναι οι αντιδράσεις με άλλους συνδετήρες (πρωτεΐνη που προσκολλάται σε πρωτεΐνη υποδοχέα) και ειδικές ενζυμικές δραστικότητες.

Ο απαιτούμενος βαθμός καθαρότητας πρωτεΐνης εξαρτάται από την προοριζόμενη τελική χρήση της πρωτεΐνης. Για ορισμένες εφαρμογές αρκεί ένα ακατέργαστο εκχύλισμα. Άλλες χρήσεις, όπως σε τρόφιμα και φαρμακευτικά προϊόντα, απαιτούν υψηλό επίπεδο καθαρότητας. Αρκετές τεχνικές για καθαρισμού πρωτεϊνών χρησιμοποιούνται για την επίτευξη ενός απαιτούμενου επιπέδου καθαρότητας.

Κάθε στάδιο καθαρισμού πρωτεΐνης συνήθως έχει ως αποτέλεσμα κάποιο βαθμό απώλειας προϊόντος. Επομένως, μια ιδανική στρατηγική καθαρισμού πρωτεϊνών είναι αυτή στην οποία το υψηλότερο επίπεδο καθαρισμού επιτυγχάνεται στα λιγότερα στάδια.

Η επιλογή των βαθμίδων που χρησιμοποιούνται εξαρτάται από το μέγεθος, το φορτίο, τη διαλυτότητα και άλλες ιδιότητες της στοχευόμενης πρωτεΐνης. Οι ακόλουθες τεχνικές είναι οι πλέον κατάλληλες για τον καθαρισμό μιας απλής κυτταρολυτικής πρωτεΐνης.

Ο καθαρισμός των συμπλοκών κυτταρολυτικών πρωτεϊνών είναι πιο περίπλοκος και συνήθως απαιτεί την εφαρμογή διαφορετικών μεθόδων.

Το πρώτο βήμα στον καθαρισμό των ενδοκυτταρικών (εντός των κυττάρων) πρωτεϊνών είναι η παρασκευή ενός ακατέργαστου εκχυλίσματος. Το εκχύλισμα θα περιέχει ένα πολύπλοκο μίγμα όλων των πρωτεϊνών από το κυτταρόπλασμα κυττάρων και μερικά επιπλέον μακρομόρια, συμπαράγοντες και θρεπτικά συστατικά.

Αυτό το ακατέργαστο εκχύλισμα μπορεί να χρησιμοποιηθεί για ορισμένες εφαρμογές στη βιοτεχνολογία. Ωστόσο, εάν η καθαρότητα είναι ένα ζήτημα, πρέπει να ακολουθούνται τα επόμενα βήματα καθαρισμού. Τα εκχυλίσματα ακατέργαστης πρωτεΐνης παρασκευάζονται με την απομάκρυνση κυτταρικών υπολειμμάτων που παράγονται από κυτταρική λύση, η οποία επιτυγχάνεται χρησιμοποιώντας χημικές ουσίες, ένζυμα, sonication ή ένα γαλλικό Press.

Τα θραύσματα απομακρύνονται με φυγοκέντρηση και ανακτάται το υπερκείμενο υγρό (το υγρό πάνω από ένα στερεό υπόλειμμα). Ακατέργαστα παρασκευάσματα εξωκυτταρικών (εκτός των κυττάρων) πρωτεϊνών μπορούν να ληφθούν με απλή αφαίρεση των κυττάρων με φυγοκέντρηση.

Σίγουρα βιοτεχνολογία εφαρμογές, υπάρχει ζήτηση για θερμοσταθερά ένζυμα-ένζυμα που μπορούν να ανεχθούν υψηλές θερμοκρασίες χωρίς μετουσίωση, διατηρώντας παράλληλα υψηλή ειδική δραστικότητα.

Οι οργανισμοί που παράγουν θερμικά ανθεκτικές πρωτεΐνες καλούνται μερικές φορές εξωφθαλίσεις. Μια εύκολη προσέγγιση για τον καθαρισμό μιας ανθεκτικής στη θερμότητα πρωτεΐνη είναι η μετουσίωση των άλλων πρωτεϊνών στο μείγμα από θέρμανση, κατόπιν ψύξη του διαλύματος (επιτρέποντας έτσι στο θερμοσταθερό ένζυμο να μετατραπεί ή να αναδιαλυθεί, εάν απαραίτητη). Οι μετουσιωμένες πρωτεΐνες μπορούν στη συνέχεια να απομακρυνθούν με φυγοκέντρηση.

Μοντέρνο βιοτεχνολογίας τα πρωτόκολλα συχνά επωφελούνται από τα πολλά εμπορικά διαθέσιμα κιτ ή τις μεθόδους που παρέχουν έτοιμες λύσεις για τυποποιημένες διαδικασίες. Ο καθαρισμός πρωτεΐνης συχνά εκτελείται χρησιμοποιώντας φίλτρα και παρασκευασμένες στήλες διήθησης πηκτής.

Ακολουθήστε τις οδηγίες του κιτ διάλυσης και προσθέστε τον σωστό όγκο της σωστής λύσης και περιμένετε το προσδιορισμένο χρονικό διάστημα ενώ συλλέγεται το έκλουσμα (ο διαλύτης που διέρχεται από τη στήλη) σε μια νέα δοκιμή σωλήνας.

Οι χρωματογραφικές μέθοδοι μπορούν να εφαρμοστούν χρησιμοποιώντας στήλες κορυφής ή αυτοματοποιημένο εξοπλισμό HPLC. Ο διαχωρισμός με HPLC μπορεί να γίνει με μεθόδους αντίστροφης φάσης, ανταλλαγής ιόντων ή αποκλεισμού μεγέθους και δείγματα που ανιχνεύονται με συστοιχία διόδων ή τεχνολογία λέιζερ.

Στο παρελθόν, ένα κοινό δεύτερο βήμα για τον καθαρισμό μιας πρωτεΐνης από ένα ακατέργαστο εκχύλισμα ήταν με καθίζηση σε ένα διάλυμα με υψηλή οσμωτική ισχύ (δηλ. Διαλύματα άλατος). Η καθίζηση πρωτεΐνης συνήθως γίνεται χρησιμοποιώντας θειικό αμμώνιο ως άλας. Τα νουκλεϊκά οξέα στο ακατέργαστο εκχύλισμα μπορούν να απομακρυνθούν με καθίζηση συσσωματωμάτων που σχηματίζονται με θειική στρεπτομυκίνη ή θειική πρωταμίνη.

Η καταβύθιση αλάτων δεν οδηγεί συνήθως σε υψηλή καθαρισμένη πρωτεΐνη αλλά μπορεί να βοηθήσει στην εξάλειψη ορισμένων ανεπιθύμητων πρωτεϊνών σε ένα μείγμα και με συγκέντρωση του δείγματος. Τα άλατα στο διάλυμα στη συνέχεια απομακρύνονται με διάλυση μέσω σωλήνωσης πορώδους κυτταρίνης, διήθησης ή χρωματογραφίας αποκλεισμού πηκτής.

Διαφορετικές πρωτεΐνες θα καθιζάνουν σε διαφορετικές συγκεντρώσεις θειικού αμμωνίου. Γενικά, πρωτεΐνες με υψηλότερο μοριακό βάρος ίζημα σε χαμηλότερες συγκεντρώσεις θειικού αμμωνίου.

Η χρωματογραφία αντίστροφης φάσης (RPC) διαχωρίζει τις πρωτεΐνες με βάση τη σχετική υδροφοβικότητα τους (αποκλεισμός μη πολικών μορίων από το νερό). Αυτή η τεχνική είναι ιδιαίτερα επιλεκτική, αλλά απαιτεί τη χρήση οργανικών διαλυτών.

Ορισμένες πρωτεΐνες μόνιμα μετουσιώνονται από τους διαλύτες και θα χάσουν τη λειτουργικότητά τους κατά τη διάρκεια της RPC. Συνεπώς, αυτή η μέθοδος δεν συνιστάται για όλες τις εφαρμογές, ιδιαίτερα εάν είναι απαραίτητη για τη διατήρηση της δραστικότητας της πρωτεΐνης στόχου.

Η χρωματογραφία ανταλλαγής ιόντων αναφέρεται στον διαχωρισμό των πρωτεϊνών με βάση το φορτίο. Οι στήλες μπορούν είτε να προετοιμαστούν για ανταλλαγή ανιόντων είτε ανταλλαγή κατιόντων. Οι στήλες ανταλλαγής ανιόντων περιέχουν μια στατική φάση με θετικό φορτίο που προσελκύει αρνητικά φορτισμένες πρωτεΐνες.

Οι στήλες ανταλλαγής κατιόντων είναι τα αντίστροφα, αρνητικά φορτισμένα σφαιρίδια που προσελκύουν θετικά φορτισμένες πρωτεΐνες. Η έκλουση (εκχύλιση ενός υλικού από το άλλο) της πρωτεΐνης (ων) στόχου γίνεται με αλλαγή του pH η στήλη, η οποία έχει ως αποτέλεσμα μια αλλαγή ή εξουδετέρωση των φορτισμένων λειτουργικών ομάδων εκάστου πρωτεΐνη.

Η χρωματογραφία αποκλεισμού μεγέθους (επίσης γνωστή ως διήθηση πηκτής) διαχωρίζει μεγαλύτερες πρωτεΐνες από μικρότερες καθώς τα μεγαλύτερα μόρια ταξιδεύουν ταχύτερα διαμέσου του διασυνδεδεμένου πολυμερούς στη χρωματογραφία στήλη. Οι μεγάλες πρωτεΐνες δεν ταιριάζουν στους πόρους του πολυμερούς ενώ οι μικρότερες πρωτεΐνες κάνουν και χρειάζονται περισσότερο χρόνο για να ταξιδέψουν μέσω της στήλης χρωματογραφίας, μέσω μιας λιγότερο άμεσης οδού.

Το έκλουσμα (το αποτέλεσμα της έκλουσης) συλλέγεται σε μια σειρά σωλήνων που διαχωρίζουν πρωτεΐνες με βάση τον χρόνο έκλουσης. Η διήθηση πηκτώματος είναι ένα χρήσιμο εργαλείο για τη συγκέντρωση ενός δείγματος πρωτεΐνης αφού η πρωτεΐνη στόχος συλλέγεται σε μικρότερο όγκο έκλουσης από ό, τι αρχικά προστέθηκε στη στήλη. Παρόμοιες τεχνικές φιλτραρίσματος μπορούν να χρησιμοποιηθούν κατά την παραγωγή μεγάλης κλίμακας πρωτεϊνών λόγω της σχέσης κόστους-αποτελεσματικότητας τους.

Η χρωματογραφία συγγένειας είναι μια πολύ χρήσιμη τεχνική για την "στίλβωση" ή την ολοκλήρωση της διαδικασίας καθαρισμού πρωτεϊνών. Τα σφαιρίδια στη στήλη χρωματογραφίας διασυνδέονται με συνδετήρες που δεσμεύονται ειδικά με την πρωτεΐνη στόχο.

Η πρωτεΐνη στη συνέχεια απομακρύνεται από τη στήλη με έκπλυση με ένα διάλυμα που περιέχει ελεύθερους προσδέτες. Αυτή η μέθοδος δίνει τα καθαρότερα αποτελέσματα και την υψηλότερη ειδική δραστηριότητα σε σύγκριση με άλλες τεχνικές.

Η SDS-PAGE (δωδεκυλοθειικό νάτριο που χρησιμοποιείται με ηλεκτροφόρηση πηκτής πολυακρυλαμιδίου) δεσμεύεται με πρωτεΐνες δίνοντας τους ένα μεγάλο καθαρό αρνητικό φορτίο. Δεδομένου ότι τα φορτία όλων των πρωτεϊνών είναι αρκετά ίσα, η μέθοδος αυτή τα χωρίζει σχεδόν εξ ολοκλήρου με βάση το μέγεθος.

Η SDS-PAGE χρησιμοποιείται συχνά για να ελέγξει την καθαρότητα της πρωτεΐνης μετά από κάθε βήμα μιας σειράς. Καθώς οι ανεπιθύμητες πρωτεΐνες απομακρύνονται σταδιακά από το μίγμα, ο αριθμός των ζωνών που απεικονίζονται στην πηκτή SDS-PAGE μειώνεται, μέχρις ότου υπάρχει μόνο μία ζώνη που αντιπροσωπεύει την επιθυμητή πρωτεΐνη.

Η ανοσοστύπωση είναι μια τεχνική απεικόνισης πρωτεΐνης που εφαρμόζεται σε συνδυασμό με χρωματογραφία συγγένειας. Τα αντισώματα για μια συγκεκριμένη πρωτεΐνη χρησιμοποιούνται σαν συνδετήρες σε στήλη χρωματογραφίας συγγένειας.

Η πρωτεΐνη στόχος διατηρείται στη στήλη, στη συνέχεια απομακρύνεται με έκπλυση της στήλης με διάλυμα άλατος ή άλλους παράγοντες. Αντισώματα που συνδέονται με ραδιενεργές ή βαφικές ετικέτες βοηθούν στην ανίχνευση της πρωτεΐνης στόχου μόλις διαχωριστεί από το υπόλοιπο του μίγματος.